Работна програма

WP4: Епигенетични биомаркери

Епигенетиката е обобщаващ термин на всичко, което е “отвъд конвенционалната генетика” и на практика включва всички механизми, които водят до стабилни промени в генната експресия и не са закодирани в първичната нуклеотидна последователност. Критичната роля на епигенетичните механизми за нормалната и малигнената хемопоеза се приема от много време насам поради изключителната динамика на клетъчната смърт, самообновяването и диференциацията на клетките в хемопоетичната система. Затова изследването на епигенетичните механизми ще допринесе за подобряване не само на познанията за хематологичните заболявания, но и ще спомогне за напредък в клиничното поведение, което ще е от пряка полза за пациентите (Mulero-Navarro and Esteller 2008). Понастоящем са известни няколко механизма за епигенетична регулация. Аберациите в ДНК метилирането, посттранслацонните модификации на хистоните, ремоделирането на хроматина и профила на експресия на миРНКи са основните епигенетични изменения и те са свързани с онкогенезата (Esteller 2008).

Всъщност основните клетъчни пътища, които допринасят за малигнения фенотип, се засягат от епигенетични измения при различните видове рак. Например свързаното с метилиране потискане на тумор супресорните гени при хематологични заболявания се отнася до инхибиторите на клетъчния цикъл p16^INK4a (особено при лимфоми) и p15^INKb (при левкемии). Въпреки това обаче независимо от хиперметилирането на CpG областите на промоторните региони на специфични гени, геномът на неопластичните клетки претърпява значитело глобално хипометилиране, каквото е доказано при остра промиелоцитна левкемия (ОПЛ) и ХЛЛ.

Вторият ключов компонент на епигетичната регулация са посттранслационните хистонови модификации. Равновесието между хистоновото ацетилиране и деацетилиране е епигетично ниво от критично значение за регулацията на генната експресия. Хистоновото ацетилиране, индуцирано от хистоновите ацил трансферази (ХАТ) е свързано с генната транскрипция, докато хистоновото хипоацетилиране, индуцирано от действието на хистоновите деацетилази (HDAC) е свързано с потискането на генната експресия. Променената експресия и мутациите на гените, които кодират HDAC, са свързани с развитието на тумори, тъй като и двата вида изменения индуцират аберантната транскрипция на ключови гени, регулиращи важни клетъчни функции като клетъчната пролиферация, клетъчния цикъл и апоптозата. За тях е доказано, че медиират функцията на продуктите от транслокациите при специфични видове левкемии (PML-RARα при АПЛ) и лимфоми (BCL-6).

24 МикроРНКите (иРНКи) са друга част от епигенетичните механизми и понастоащем са обект на огромен интерес в научната литература. миРНКите участват в ключови биологични процеси, включително развитието, диференциацията, апоптозата и пролиферацията чрез ненапълно комплементарно свързване с таргетни матрични РНКи (мРНКи) на кодиращи белтъци гени и транскрипционната и посттранскрипционната регулация на тяхната експресия. Много видове рак са анализирани за профила на експресия на миРНКи и показват разлика с профила на експресия на нормални клетки от същите тъкани. Последните широки проучвания показват, че определянето на екпресията на миРНКи било то чрез количествен PCR или „микрочипове” може да има диагностични, прогностични или терапевтични възможности при хематологичните неоплазии (ОМЛ, ХЛЛ и т.н.) (Fabbri, et al 2008, Lawrie 2007).

Съвсем ясно е, че епигенетичните промени действат заедно с генетичните промени при развитието и прогресията на неопластичния процес. Като се има пред вид критичната роля на миРНКите и епигенетичните механизми при рака, характеризирането на епигенетичната регулация чрез миРНКи ще осигури нови възможности за разработване на ракови биомаркери за клинична употреба за ранно установяване на заболяванията, туморната класификация и отговора към класически химиотерапевтични средства, таргетна терапия и епигенетични средства. Обещаващи резултати са получени с инхибиторите на хистондеацетилазите и ДНК метилрансферазите, които са довели до официално одобрение на някои от тях за лечение на хематологичните неоплазии и лимфопролиферативни заболявания като миелодиспластични синдроми и кожни лимфоми.

Въпреки това много задачи остава да бъдат изпълнени, като клиничното валидиране на епигенетични маркери, което да позволи точното предвиждане на резултатите при пациенти с хематологични заболявания и тяхната потенциална чувствителност към настоящите видове фармакологично лечение.

Независимо от широките проучвания, които настоящият изследователски екип е извършил досега върху молекулярните аспекти на хематологичните заболявания и фенотипните и биологичните последствия, досега не са извършвани изследвания върху епигенетичните механизми. Амбицията на изследователския екип обаче е да се разшири областта на приложение на методологичните подходи, насочени към епигенетични и миРНКи биомаркери, тъй като това е предварително условие за реализирането на глобален многостранен подход към хематологичните неоплазии. Разработен е и внесен за финансиране проект за определяне профила на експресия на миРНКи при остри миелоидни левкемии от изследователската група на НСБАЛХЗ в сътрудничество с Партньор#3 и Университета в Перуджа, Италия [текущ]. Чрез разширяване обхвата на дейностите ние целим конвергенция на изследователската практика в участващите звена към международно утвърдените стандарти за изследователска дейност в хематологията и полагане на техническите основи за бъдещо възможно приложение на основани на миРНКи видове терапия.

Цели

• да се установят работещи методи за идентифициране на известни и нови епигенетични маркери при хематологичните неоплазии
• да се въведе работеща комерсиално достъпна течна система с микросфери за определяне профила на експресия на миРНКи
• да се подобрят знанията за взаимодействието между генетични, епигенетични и клинични резултати и избора на терапия и отговора към нея
• да се осигури научно и методологично обучение на млади изследователи за епигенетични методи
• да се създадат технологични и методологични предпоставки за трансфер на тези маркери в клинични изследвания за оценка на индивидуалната прогностична стойност
• да се разработят насоки за употреба на нови молекулярни микросферови методи за хематологични заболявания за рутинна диагностика
• да се обмени информация за получените резултати и да се колаборира в рамките на международна мултидисциплинарна професионална общност като Epigenome- Network of Excellence (www.epigenome-noe.net).

Осъвременяване на оборудването

За да се осигури надеждно и стабилно функциониране на Епигенитечното направление в допълнение към вече съществуващото оборудване бенефициентът ще се нуждае от следното: 4-капилярен секвенатор [също WP3], платформа за течен микросферов чип за определяне профила на експресия на миРНКи LuminexTM, машина за изработване на тъканни микрочипове [също WP2]; система за електрофореза на белтъци и блотинг, система за детекция на хемилуминесценция и платформа за изолиране на ДНК/РНК [също WP3].

Очаквани резултати

• работеща IHC платформа за изследване на глобалния профил на хистоновите модификации при хематологични неоплазии и тяхната стойност като биомаркери
• високопроизводителна платформа за определяне на глобалния профил на експресия на миРНКи
• осигуряване на нови епигенетични платформи за развитието на бъдещата кариера на млади изследователи
• повишаване на изследователските познания и умения чрез трансфер на технологии в епигенетиката
• подобрено обучение на мултидисциплинарни експерти по геномна биология, епигенетика и транслиращи изследвания

Основни моменти

До месец 9. ще бъдат извършени процедури по закупуване и инсталиране на оборудване. До месец 12. се очаква цялото оборудване на функционира напълно.

Етапен отчет (изтегли pdf файл)