Работна програма

WP3: Цитогенетични и молекулярни биомаркери

Развитието на левкемии и лимфоми е резултат от натрупването на придобити генетични изменения и епигенетични промени, които нарушават нормалните механизми на клетъчния растеж, пролиферация и диференциация на хемопоетичните прогениторни клетки. Съществуващите хромозомни нарушения и/или молекулярни изменения в малигнените клетки могат също да определят много от клиничните характеристики преди лечението на пациентите с различни хематологични неоплазии, както и по-нататъшния клиничен ход на заболяването и прогнозата. Затова някои от тези патологични промени се използват като биологични маркери за установяване и потвърждаване на диагнозите съгласно класификацията на туморите на хемопоетичната и лимофиидна тъкан, разработена от Световната здравна организация (Jaffe 2001), за определяне стадия на заболяването, за мониториране ефикасността на терапията, за установяване на минимална резидуална болест, за предвиждане на клиничния резултат. Освен това познанията за биологията на хематологичните неоплазии и подлежащите генетични нарушения са основа за разработване на специфична молекулярна терапия (Perl and Carroll 2007). Основните подходи, използвани за установяване на генетични нарушения, включват класически цитогенетични методи, качествена и количествена полимеразна верижна реакция (PCR), флуоресцентна in situ хибридизация (FISH), спектрално кариотипизиране (SKY), сравнителна геномна хибридизация (CGH) и различни „микрочип” методи.

Практическата приложимост на генетичните маркери в хематологията е ограничена поради два основни фактора: само малка част от тях имат ясно определено клинично значение и честотата им при определено заболяване обикновено е относително ниска. От друга страна често в рамките на групите пациенти с нормален кариотип или с рекурентни неслучайни цитогенетични находки с установено прогностично значение могат да се отграничат пациенти, чийто клиничен ход и резултати са различни в сравнение с останалите пациенти. Няколко групи доказателства показват, че тези разлики са свързани с различни допълнителни молекулярни нарушения като генни пренареждания, мутации или промени в генната експресия. Очевидно е, че за да се подпомогне стратификацията на тези пациенти според риска, избора на терапия според риска и мониторирането на тази терапия, са необходими повече маркери за прогностична оценка на този риск.

Прилагането на нови технологии през последните години позволи откриването на голям брой молекулярни маркери, включително променящи функцията генетични мутации или аберантна нива на експресия на гените, регулиращи критични пътища в хемопоезата, които откриха важна ера в диагностичното субтипизиране на хематологичните неоплазии, формулирането на класификация на заболяванията въз основа на определяне на профила на генна експресия, идентифицирането на нови прогностични маркери и по-добро прогнозиране на клиничните резултати при определени нозологични единици, както и при разработването на лекарства. Примери за генни мутации са тези, засягащи гените CEBPa, NPM1, FLT3/ITD, KIT, и т.н. при остра миелоидна левкемия (ОМЛ), JAK2 V617F мутация и MPL мутации при BCR-ABL негативни хронични миелопролиферативни заболявания (МПЗ), ABL 315 при BCR-ABL- позитивна хронична миелоидна левкемия (ХМЛ) или аберантна генна експресия на WT1, hTERT, BAALC, VEGF ligand, Survivin, MN1, ERG, MLF1, EVI1 при ОМЛ. Тези предварителни данни обаче се нуждаят от валидиране в големи проспективни проучвания чрез използване на конвенционални методи като качествен и количествен PCR преди въвеждането им в употреба за терапевтичното планиране и стратификация.

Лабораторията по цитогенетика и молекулярна биология е с богат опит в многостранни проучвания на генетичните аберации при онкохематологични заболявания чрез прилагане на конвенционален цитогенетичен анализ, флоресцентна in situ хибридизация (FISH), молекулярно-генетичен анализ чрез PCR методи, включително Nested Primers PCR, вътреклетъчен RT-PCR, PCR-RFLP, PCR-ELIS), количествен PCR в реално време, ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System) и т.н. за изследване на експресията на фузионни гени, анализ на аберантна генна експресия и генни реаранжировки. Тя е достатъчно оборудвана за дейностите, извършвани досега [Вж. точка 3.]. Въпреки това обаче молекулярните проучвания непрекъснато се увеличават в цялостния интегриран подход при неопластичните заболявания, и по специално на хемопоезата. Съществува непрекъсната необходимост да се валидират специфични нови молекулярни изменения, които корелират с характеристиките на пациентите преди лечение, отговорът към лечението или клиничните резултати като потенциални биомаркери. Освен това клиничната използваемост на голям брой исторически молекулярни маркери трябва да се подобри и преоцени, особено в рамките на новите видове терапия. Затова подобряването на лабораторните условия е много важно с оглед посрещането на нарастващите нужди. Освен това, както беше споменато по-горе все повече данни предвиждат ролята на генните мутации в протоонкогени, които биха могли да се окажат полезни биомаркери. Изследването им от своя страна изисква секвенационен анализ и съответно оборудване.

Цели

• да се разширят възможностите и ефективността на Молекулярното направление по отношение на нарастващия брой изследвания.
• да се въведе секвенационен анализ за генни мутации.
• да се осигури по-широк достъп до високо технологичен интегриран панел от молекулярни и генетични техники, което би позволило проучвания върху генома на неопластичните клетки на всички нива, включително хромозоми, ДНК, РНК.

Осъвременяване на оборудването

Подсилването на молекулярното звено с допълнително оборудване като PCR бокс, допълнителен термосайклер, електрофоретични вани и електрически източник ще позволи посрещането на нарастващия брой и сложност на транслиращите изследователски дейности. Освен това осигуряването на секвенатор ще бъде необходимо, за да се попълни спектъра от приложни молекулярни подходи.

Очаквани резултати

• повишен капацитет за PCR изследвания
• създаване на възможности за секвениране, включително разработване на СОП за секвениране на проби от пациенти
• оправдано от финансова и времева гледна точка широкомащабно изследване на генетични и молекулярни маркери при условията на транслираща медицина
• повишени възможности за идентифициране и изследване на нови биомаркери в онкохематологията

Основни моменти

До месец 9. ще се изпълнят процедурите по закупуване и инсталиране на основната част от оборудването. До месец 12. се очаква цялото оборудване да функционира напълно.

Етапен отчет (изтегли pdf файл)