Работна програма

WP2: Клетъчни и имунологични биомаркери

Въпреки че клиничните показатели, които представяват сурогатни маркери за водещите биологични механизми, могат да осигурят полезна диагностична и прогностична информация за пациента, съществува ясна необходимост от разработването на нови биомаркери при хематологичните неоплазии, които могат лесно и с добра възпроизводимост да се прилагат в клинични условия. В онкохематолгията са идентифицирани са множество нови молекулярни и имунологични маркери, дефинирани като биомаркери, които

1. могат да се използват за откриване на специфично заболяване или подтип заболяване [напр. патологчната цитоплазмена локализация на нуклеофосмин (NPM), която е предиктивна за мутации на NPM1 гена и дефинира подгрупа остри миелоидни левкемии (ОМЛ) с мутации на NPM1 гена съгласно СЗО класификацията от 2008 г., или t(8;14) транлокацията, установена чрез флуоресцентна in situ хибридизация (FISH), която дефинира лимфома на Burkitt];
   или
2. са предиктивни за изхода от заболяването и могат да се използват в допълнение към наличните понастоящем индекси за оценка на риска [напр. позитивност за ZAP-70, установена чрез имуномаркиране, за която е доказано, че корелира с мутационния статус на гените за вариабилните участъци на тежките вериги на имноглобулините (IgVH), както и със значително по-лош клиничен изход, и която е предложена като главен сурогатен прогностичен фактор при хроничната лимфоцитна левкемия (ХЛЛ)];
   или
3. се очаква да заменят клинично дефинирана крайна цел [напр. ерадикирането на минималната резидуална болест (МРБ) при ХЛЛ се оказва желана терапевтична крайна цел, предиктивна за по-добър клиничен изход];
   или
4. се очаква или нов вид терапия [напр. доказването на повърхностен CD20 антиген върху лимфомни/левкемични клетки е предварително условие за таргетна терапия с анти-CD20 моноклонални антитела като Rituximab].

Значителна част от лабораторното оборудване и експертни умения на Лабораторията по цитопатология, хистопатология, имунология и имунохимия на НСБАЛХЗ са посветени на анализа на широк спектър от маркери при пациенти с левкемии и лимфоми на ниво на отделната клетка чрез имунофенотипизиране, цитохимия, вътреклетъчен PCR (Вж. точка 3.). Лабораторията е оборудвана с настолни флоуцитометри [3-цветен FACSCalibur и 8-цветен FACSCanto II], което гарантира високо производителни флуоресцентни анализи в течна среда. Нашият нисък капацитет за оцветяване и последваща морфологична оценка обаче е лимитиращ фактор, водещ до по-бавния оборот на различни проекти, които биха се нуждаели от “in situ” визуализация на изследваните биомаркери. Всички подготвителни стъпки преди оценката (нагряване, депарафиниране, разкриване на антигенни епитопи, маркиране чрез контраоцветяване) се извършват ръчно. Към трудоемкото естество на процедурите, което е основното ограничение на молекулярните и имунологичните анализи на биомаркери в туморни тъкани, се добавят и ограничените наличности на диагностични реактиви и ограничен размер на извадката пациенти. Тези ограничения са валидни не само за нашата дейност и за всички изследователски групи. За преодоляване на проблемите през последните години беше разработена техниката „тъканен микрочип”, която позволява получаването на микрочип блокче, състоящо се от отделни тъканни цилиндри (до 1000) от проби от различни пациенти, организирани по чипов начин, което да позволи едновременен хистологичен анализ. Блокчето може да бъде нарязано на 100–500 среза, които могат да се подложат на отделни независими изследвания, които най-често използват имунохистохимия (IHC) и FISH. Тъканните микрочипове са важен напредък в транслиращите изследвания.

Освен това, голямото разнообразие в използваните методи за маркиране показва необходимостта от стандартизиране и по-строг контрол на качеството на имунохистохимичните и FISH техники. Ние можем да постигнем необходимото последователност, възпрозводимост и по-добра стандартизация чрез автоматизране на процеса на маркиране с въвеждане в действие на автоматизирана платформа за IHC и FISH.

Широкото използване на флуоресцентно маркираните антитела, лиганди и бои за локализиране на специфични молекули и проследяване на морфологичните промени в клетките налага необходимостта от оборудване с флуоресцентен микроскоп с висока разделителна способност и възможност за триизмерна реконструкция на образа и обработка, което значително ще подобри резултатите от нашите изследвания на клетъчно ниво.

Въвеждането на нови технологии и оборудване ще ни позволи в значителна степен да повишим капацитета на лабораторията, което ще разширяване обема на проучванията, разширяване на панелите от изследвани биомаркери и спектъра на заболяванията в сътрудничество с нови парньори.

Цели

• да се осигурят високи стандарти при затваряне на пълния цикъл от обработка на пробата, маркиране и оценка на молекулярните и имунологични маркери при хематологични заболявания на ниво на единичната клетка.
• да се създаде съвременна технологична платформа за възпроизводими, постоянни, подлежащи на качествен контрол и стандартизация имунохистохимични и клетъчни молекулярни анализи чрез въвеждане на автоматизирана платформа за маркиране.
• да се въведе оборудване за тъканни микрочипове в лабораторната практика
• да се създадат тъканни микрочипове от определени хематологични неоплазии, включително редки заболявания, чрез използване на архивни тъканни проби и да се предоставят за изследване на РНК и белтъчни мишени.
• да се въведе висок клас флуоресцентна микроскопия с висока разделителна способност за локализиране на специфични вътреклетъчни или мембранни молекули
• да се улесни достъпа до съвременни технологии и инструменти за партниращите изследователи, които не са непосредствено ангажирани с тези методи, но провеждат проспективни проучвания на клетъчно ниво, чрез осигуряване на апаратура и експертни умения за мултипараметърна флоуцитометрия и визуализиране на имунологични и молекулярни „обекти” “in situ”.

Осъвременяване на оборудването

Възможностите ни за клетъчно маркиране значително ще бъдат подобрени с въвеждането на автоматизирана система за имунохистохимия и in situ хибридизация с компютърен контрол за контрол на партидите, термична обработка, депарафиниране и разкриване на епитопи чак до процесите на контраоцветяване. Системата за тъканни микрочипове ще доведе до няколко ползи, като напр. минимизиране на консумацията на често уникални, безценни туморни проби, инвестициите за реактиви и лабораторен персонал, ще осигури възможност за бърза оценка in situ на ролята на нормални и абнормни гени и техните продукти на стотици тъкани едновременно. Конфокалният микроскоп, оборудван със система за анализ на образи е безценно средство за флуоресцентна микроскопия с висока разделителна способност и малко изследователски центрове са без поне един такъв инструмент. Ще е необходим също допълнителен стандартен хладилник (4ºC/-20ºC) за съхранение на реактиви, а един инкубатор (30-70ºC) с обем 30-32 l, ламинарен бокс, водна баня с дигитален контрол до 95ºC, пипетори, нагряващ блок (4-100ºC) и Milipore система за дейонизирана вода, които значително ще подорят оборудването на лабораторията и резултатите.

Очаквани резултати

• съвременна технологична платформа за финансово-ефективно и високопроизводително създаване на тъканни микрочипове
• съвременна автоматизирана технологична платформа за финансово-ефективни и високопроизводителни имунохистохимични и клетъчни FISH анализи, подлежащи на качествен контрол и стандартизиране
• повишени възможности за флуоресцентна и светлинна микроскопия с висока разделителна способност с анализ и съхранение на образи
• подобрен капацитет и резултати на Направлението за имунофенотипни и клетъчни биомаркери
• като пряк резултат могат да бъдет приети и самите създадени тъканни микрочипове, представляващи различни нозологични единици, различни прояви и/или локализации на заболяванията, различни етапи на заболяването (към диагнозата, рецидив, прогресия).

Основни моменти

До месец 9. ще бъдат извършени процедурите по закупуване на оборудването, а до месец 12. се очаква да цялото оборудване да функционира напълно. Ще бъдат създадени тъканни микрочипове съгласно план, одобрен от партньорите до месец 12., като на редовни времеви периоди (месеци 18., 24., 30., 36.) ще се обменя информация за броя и компонентите на микрочиповете между партньорите и ще се планира дизайна на определени проучвания.

Етапен отчет (изтегли pdf файл)